GLP -1(وصلة:https://www.bloomtechz.com/synthetic-chemical/peptide/glp-1-peptide-cas-87805-34-3.html) هو هرمون متعدد الببتيد يتكون من 30 حمض أميني. من خلال البحث المتعمق حول GLP -1 ، تم تطوير المزيد والمزيد من الأساليب التركيبية. ستقدم هذه المقالة بشكل منهجي طرق التجميع المعروفة حاليًا لـ GLP -1.
الطريقة الأولى ، تركيب المرحلة الصلبة:
يُعد تخليق الطور الصلب طريقة مستخدمة على نطاق واسع لتخليق الببتيد والبروتين ، كما أنها تستخدم بشكل شائع لتخليق GLP -1. في تركيب المرحلة الصلبة ، يتم تشكيل الهيكل الأساسي عن طريق ربط أول حمض أميني بالراتنج. بعد ذلك ، يضاف الحمض الأميني التالي بالتسلسل ويتفاعل كيميائيًا مع عامل تكثيف مناسب. أخيرًا ، يمكن الحصول على المنتج المستهدف عن طريق شق البولي ببتيد من الراتينج.
تكمن أهمية تخليق المرحلة الصلبة في أنه يتيح الأتمتة والإنتاج على نطاق واسع لتخليق الببتيد. تتضمن طرق تخليق المرحلة الصلبة الحالية السائدة Fmoc و Boc. من بينها ، تستخدم طريقة Fmoc مجموعة الحماية N-Fmoc لحماية الببتيد ، بينما تستخدم طريقة Boc ثلاثي بيوتيلوكسي كاربونيل لحماية مجموعة الكربوكسيل.
الطريقة الثانية ، تخليق المرحلة السائلة:
يُعد تخليق المرحلة السائلة طريقة تقليدية لتخليق الببتيد حيث يتم وضع المواد المتفاعلة في الطور السائل للتفاعل. تتمثل ميزة تخليق المرحلة السائلة في أن ظروف التفاعل خفيفة ومناسبة لتعديل الهياكل الكيميائية الحساسة. ومع ذلك ، نظرًا لوجود عدد كبير جدًا من المتفاعلات ، فإن عملية التنقية مرهقة نسبيًا. تشمل التفاعلات الكيميائية في تخليق المرحلة السائلة ما يلي:
1. تفاعل التكثيف:
تفاعل التكثيف هو أحد التفاعلات الأساسية في تخليق الببتيد ، أي أن مجموعة الكربوكسيل التي بدأتها عوامل التكثيف مثل DCC و HOBt متصلة بالمجموعة الأمينية من الأحماض الأمينية من خلال تفاعل الأسيل. تكون ظروف التفاعل خفيفة والعائد مرتفع.
2. ردود فعل القضاء:
رد فعل الإزالة هو اختزال الميثيونين إلى ديثيول بواسطة NaBH4 وعوامل الاختزال الأخرى ، مما يجعله غير نشط. يجب تنفيذ التفاعل في ظل الظروف الأساسية.
3. إبعاد المجموعات الحامية:
نظرًا للوظائف المختلفة للأحماض الأمينية في سلسلة الببتيد ، سيتم استخدام مجموعات حماية مختلفة للحماية. بعد اكتمال التركيب ، يجب إزالة المجموعة الحامية. بالنسبة لطريقة Fmoc ، عادة ما يستخدم بيبيريدين لإزالة Fmoc ؛ بينما بالنسبة لطريقة Boc ، يتم استخدام TFA لإزالة Boc.
الطريقة الثالثة ، التركيب الكيميائي:
GLP -1 هو هرمون متعدد الببتيد له أنشطة بيولوجية مهمة. يمكن تحقيق تركيبها بطرق مختلفة ، من بينها التخليق الكيميائي هو أحد أكثر الطرق شيوعًا. تتمثل ميزة التخليق الكيميائي في قدرته على إنتاج منتجات مستهدفة عالية النقاء ، ومناسبة للإنتاج على نطاق واسع. سيتم تقديم طريقة التركيب الكيميائي والخطوات التفصيلية لـ GLP -1 أدناه.
1. الطريق الاصطناعية واختيار مجموعة الحماية:
يتكون جزيء GLP -1 من 36 حمضًا أمينيًا ، بما في ذلك 21 نوع L و 15 نوع D. قبل تنفيذ التخليق ، من الضروري اختيار طريق اصطناعي مناسب واختيار مجموعة الحماية المقابلة وفقًا للظروف التركيبية. عادةً ما يتم استخدام تخليق المرحلة الصلبة Fmoc للتوليف الآلي على نطاق واسع. تستخدم هذه الطريقة N -9- حماية فلورو إيميدو الكربوكسيل (N-Fmoc) كمجموعة حماية ، وتحتاج أيضًا إلى تحديد مجموعة حماية ثانوية مناسبة (مثل ثلاثي بيوتيل أو ميثيل) لضمان حماية مواقع معينة. في كل مرة يتم فيها إضافة حمض أميني جديد ، يجب إزالة مجموعة الحماية Fmoc أولاً ، ثم يتم إضافة مادة الاقتران المحمية للحمض الأميني التالي.
2. توليف تسلسل الأحماض الأمينية الأساسية:
يتكون التسلسل الأساسي لـ GLP -1 من 21 حمض أميني ، بما في ذلك سيرين رئيسي وأربعة متواليات ثنائية الببتيد من حمض البرولايل الجلوتاميك. في تركيب الطور الصلب ، يمكن تقسيم توليف التسلسل الأساسي إلى الخطوات التالية:
2.1. أضف كربامات حمض الأسيتيك (Fmoc-NH-CH2CO2Et) و 2- Cl-Trt-Cl إلى الراتنجات الاصطناعية ذات المرحلة الصلبة ، وقم بإجراء تفاعل التكثيف باستخدام عامل اقتران DIC / NMM.
2.2. قم بإزالة مجموعة الحماية Fmoc عن طريق منع تفاعل المجموعة.
2.3 أضف الحمض الأميني التالي ، كرر الخطوتين 1 و 2 بالتسلسل حتى يتم تصنيع التسلسل الأساسي.
2.4 تشكيل هياكل خماسية الببتيد على راتنج المرحلة الصلبة. أضف كاشف الأستلة إلى راتنج المرحلة الصلبة ، وتفاعل مع عامل التعرف على الطرف N (مثل HBTU) ، وأضف مجموعة حماية السلسلة الجانبية للسيرين كعامل اختزال مساعد ، ثم قم بإزالة مجموعة الحماية Fmoc.
2.5 تحت تحفيز Bacillus subtilis transferase (ProTide) ، يخضع هيكل pentapeptide لتفاعل متبادل مع سلائف iodoacetate سيرين.
3. توليف تسلسل الأحماض الأمينية المتبقية:
بعد الانتهاء من تركيب التسلسل الأساسي ، من الضروري الاستمرار في إضافة الأحماض الأمينية المتبقية ، بما في ذلك الأحماض الأمينية من النوع L و D. يجب أن تبدأ إضافة هذه الأحماض الأمينية من التسلسل الأساسي ، وإضافة الحمض الأميني التالي بالتسلسل ، واستخدام عامل التكثيف المقابل لإجراء تفاعلات كيميائية حتى يتم تصنيع جزيء بولي ببتيد GLP كامل -1. أثناء هذه العملية ، من الضروري أيضًا اختيار مجموعة حماية مناسبة حسب الحاجة ، وتنفيذ خطوات التفاعل وإزالة مجموعة الحماية وإضافة الأحماض الأمينية بالتسلسل.
4. معالجة هيدروكسيد الصوديوم:
بعد إضافة جميع الأحماض الأمينية ، تتشكل سلسلة ببتيدية غير مكتملة التركيب على راتنج المرحلة الصلبة وتحتاج إلى معالجتها لتشكيل جزيء ببتيد كامل التكوين. أولاً ، يجب تحلل الببتيد غير المشكل بالماء بواسطة هيدروكسيد الصوديوم ، بحيث يتم فصل مجموعة الكربوكسيل الطرفية C المرتبطة أصلاً بالراتنج عن الراتينج ، ويتم فصل المجموعة الواقية في الماء. بعد تفاعل التحلل المائي ، يتم الحصول على المنتج المستهدف.
5. الترسيب والغسيل:
بعد المعالجة ، يتم معالجة المحلول المتحلل بالماء بالحمض لترسيب المنتج المستهدف. بعد ذلك ، تم إعادة تعليق الحبيبات في الماء ، متبوعًا بغسل مكثف لإزالة الشوائب.
6. التنقية:
تتمثل الخطوة الأخيرة في تنقية المنتج المطلوب ، وعادةً ما يتم ذلك باستخدام كروماتوجرافيا سائلة عالية الأداء. خلال هذه العملية ، يمكن تحديد نقاء المنتج عن طريق الكشف عن ذروة المحلول في الطيف الكتلي. باختصار ، يتطلب التركيب الكيميائي لـ GLP -1 جولات متعددة من التفاعلات المعقدة وعمليات التنقية الصارمة للحصول أخيرًا على المنتج المستهدف النشط.
الطريقة الرابعة ، التخليق الحيوي:
GLP -1 هو هرمون متعدد الببتيد مهم له تأثيرات فسيولوجية مختلفة ، بما في ذلك تعزيز إفراز الأنسولين ، وقمع الشهية ، وتقليل وزن الجسم والحفاظ على حساسية الأنسولين ، وما إلى ذلك. يتم تصنيع طريقة التخليق الحيوي لـ GLP -1 بشكل أساسي بواسطة الخلايا L في غدة البنكرياس ، ويتم تنظيم معدل تخليقها من خلال المدخول الغذائي. يتم تقديم الخطوات التفصيلية على النحو التالي:
1. الأعمال التحضيرية قبل التجميع:
قبل التخليق الحيوي لـ GLP -1 ، يجب القيام ببعض الأعمال التحضيرية ، بما في ذلك تحديد نوع الخلية المستخدمة ، وتعيين ظروف الاستنبات واختيار الإنزيم الحفاز المناسب. الخلايا L هي المصدر الرئيسي لتخليق GLP -1 لأنها تحتوي على سلائف لهرمونين ، GIP (الببتيد الشبيه بالجلوكاجون 1) و GLP -1. يمكن عزل الخلايا L من الظهارة المعوية للأرانب أو الفئران. قبل التخليق الحيوي ، تحتاج الخلايا إلى الاستزراع لعدد كافٍ ، وينبغي توفير المغذيات الكافية وظروف الاستزراع المناسبة. بالإضافة إلى ذلك ، من الضروري اختيار الإنزيم الحفزي المناسب لتعزيز التفاعل.
2- توليف ومعالجة السلائف:
يحدث التخليق الحيوي لـ GLP -1 بشكل رئيسي في الخلايا L ، وتتكون سلائفها من هرمونين ، GIP و GLP -1. بعد دخول خلايا الغدد الصماء ، تتم معالجة GIP و GLP -1 بواسطة الإنزيمات المحللة للبروتين وتنقسم إلى ببتيدات فردية. تشارك سلسلة من الإنزيمات والعوامل المساعدة في هذه العملية ، بما في ذلك السلائف polypeptide acidase (PC2) ، والأيزوميراز ، وعوامل الالتصاق المتأخرة.
3. التحويل المتبادل بين قطاعات عديد الببتيد:
بعد المعالجة ، يتم إعادة اتحاد ببتيدات GIP و GLP -1 لتكوين عديد ببتيد GLP -1. تتطلب هذه العملية استخدام الببتيد 1 الشبيه بالجلوكاجون (GLP -1) كقالب يتم فيه دمج الببتيدات الفردية الأخرى لتكوين عديد ببتيدات مركبة جديدة. تتطلب هذه العملية أيضًا بعض الإنزيمات والعوامل المحددة ، بما في ذلك Prohormone Convertase 1/3 (PC1 / 3) و Carboxypeptidase E (CPE).
4. إفراز GLP -1:
بعد تصنيع GLP -1 ومعالجته ، يتم تخزينه في السيتوبلازم والحويصلات الداخلية لخلايا الغدد الصماء. عندما يتم تحفيزها بالنظام الغذائي ، تفرز خلايا الغدد الصماء GLP -1 وتدخل الدورة الدموية من خلال الأوعية الدقيقة. يتم تنظيم هذه العملية والتحكم فيها من خلال سلسلة من مسارات تحويل الإشارة ، بما في ذلك cAMP-Ca2 زائدوما إلى ذلك وهلم جرا.
باختصار ، يتضمن التخليق الحيوي لـ GLP -1 العمل المشترك للروابط والعوامل المتعددة. يمكن أن يوفر الجمع بين التخليق الحيوي والتوليف الكيميائي أساسًا أفضل ودعمًا لبحث وإنتاج GLP -1.
الطريقة الخامسة ، التركيب الأنزيمي:
التوليف الأنزيمي هو تخليق سلاسل الببتيد من خلال تحفيز الإنزيمات البيولوجية. بالمقارنة مع طرق التوليف التقليدية للطور السائل ، يمكن إجراء التخليق الأنزيمي في درجة حرارة الغرفة ، ويمكن اختيار مجموعة واسعة من المواد الخام. عادة ما تستخدم الإنزيمات مثل سينثاس ثيتا السائل ، و AEP ، و ACE ، وما إلى ذلك لتحفيز التوليف.
في الختام ، الطرق المذكورة أعلاه هي طرق مجدية لتركيب GLP -1. الطرق المختلفة مناسبة لمختلف الظروف التجريبية وبيئات الإنتاج الصيدلاني.